用原位PCR方法检测鼻咽癌组织中的EB病毒

中华肿瘤杂志 2000年第1期第22卷 基础研究

作者：许亮国　杨旭宇　谢鹭　陈曲侯　王珣章　姚开泰

单位：许亮国（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，410078，长沙）；杨旭宇（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，410078，长沙）；谢鹭（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，410078，长沙）；陈曲侯（中山大学生命科学院，广州）；王珣章（中山大学生命科学院，广州）；姚开泰（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，410078，长沙）

　　关键词： 鼻咽肿瘤；爱泼斯坦-巴尔病毒；聚合酶链反应；原位杂交

　　【摘要】　目的　探讨在鼻咽癌组织石蜡切片标本中原位检测EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)的更灵敏的方法。方法　用地高辛标记的EBV DNA的BamHI-W片段为探针,分别用原位杂交、原位PCR的方法检测鼻咽癌组织切片中EBV的分布情况。结果　原位PCR比原位杂交检测EB病毒的方法更灵敏。结论　用原位PCR检测鼻咽癌组织切片中EB病毒不失为一种灵敏的方法。

Detecting Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma tissue using in situ polymerase chain reaction

XU Liangguo, YANG Xuyu, XIE Lu, et al.

　　（ Key Laboratory of Carcinogenesis of Chineses Ministry of Public Health, Hunan Medical University, Changsha, 410078, China）

　　【Abstract】　Objective　To develop a sensitive non-isotopic method for in situ detection of Epstein-Barr virus (EBV) in paraffin-embedded section of nasopharyngeal carcinoma (NPC) tissue.Methods　The EBV BamHI-W fragment labeled with digoxigenin as probe was used to perform in situ hybridization and PCR in situ hybridization (in situ PCR).Results　The method of in situ PCR for the detection of EBV in NPC tissue was proved to be much more sensitive than in situ hybridization.Conclusion　Hybridization in situ of PCR product is useful to detect EBV in NPC tissues.

　　【Subject words】　Nasopharyngeal neoplasms; Epstein-Barr virus; Polymerase chian reaction; In situ hybridization

　　原位PCR（in situ polymerase chain reaction，ISPCR）始于90年代初期^［1,2］，目前，这一技术主要用来检测细胞内外源性DNA或RNA（主要是病毒）。病毒进入宿主细胞后,能在静止状态下保持很长时间甚至几年，细胞处于潜伏感染状态,病毒DNA 或RNA 的拷贝数低，用一般的原位杂交方法很难检测到病毒的存在，而原位PCR技术可以在组织中原位检测出低拷贝甚至单拷贝的病毒DNA或RNA序列，这对疾病作出早期诊断，对于发病机制的研究和疾病预防具有重要意义。原位PCR对研究艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）^［3］、人类乳头病毒（human papillomavirus，HPV）^［2］等多种病毒基因的隐性感染及发病机理等方面作出了巨大贡献，但目前尚未见有用原位PCR方法来检测EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）的报道，为此，我们就EB病毒的原位PCR检测方法作一探讨。

　　材料与方法

　　1.标本:由湖南省肿瘤医院病理科病理诊断为低分化鳞癌的鼻咽癌组织活检石蜡标本19例，慢性鼻咽炎标本6例。连续切片（厚4 μm）粘贴于经2% 3-氨基丙基三已氧硅烷（3-aminopropyltriethox-ysilane, APES）处理过的载玻片上，每例切取10片，分别用来做常规HE染色、原位杂交、原位PCR及阴性对照。

　　2.探针制备:EBV BamHI-W片段由重组的pBR322质粒中酶切回收，用dig DNA labeling and detecting kit (Boehringer Mannhein产品，Cat.No.1 093 657)进行标记。

　　3.原位PCR: 切片标本用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K消化处理。将反应混合物10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，50 mmol/L KCl，0.1% Triton X-100，4.5 mmol/L MgCl₂，200 μmol/L dNTPs，0.08% BSA，20 μmol/L 引物（EW1：5′-TTTGGAC-CCGAAA

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