作者：尹鸣，陈龙邦，耿怀成，臧静

紫杉醇抗肿瘤血管生成作用的实验研究

尹鸣，陈龙邦，耿怀成，臧静

（南京军区南京总医院肿瘤科。江苏南京210002）

摘要：目的：探讨紫杉醇的抗肿瘤血管生成作用。 方法：以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）原代培养模型，MTT法测定紫杉醇对HUVEC增殖的影响；采用鸡胚尿囊膜血管形成模型（CAM模型），观察紫杉醇对鸡胚尿囊膜新生血管的抑制作用。结果：紫杉醇在非细胞毒浓度下可在体外抑制HUVEC的增殖，在体内抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成。结论：紫杉醇在非细胞毒浓度下具有抗血管生成作用。

关键词：紫杉醇；血管生成/肿瘤；人脐静脉内皮细胞；鸡胚尿囊膜血管形成模型

中图分类号： 文章标识码：A 文章编号：

The experimental study of Paclitaxel on inhibiting angiogenesis

Yin Ming, Chen Long-bang, Geng Huai-cheng, Zang Jing

(Department of Oncology, Jinling Ho ital, Nanjing 210002, Jiangsu, China)

A tract: Objectives: To investigate the antiangiogenesis ability of Paclitaxel. Methods: Human umbilical vein endothelial cells were cultured primarily in vitro and influence of Paclitaxel on HUVEC proliferation was evaluated by MTT method. Chick chorilallantoic membranes(CAM) model was used to check whether the neovascularization of CAM could be su re ed in vivo. Results: Paclitaxel both inhibited proliferation of HUVEC in vitro and su re ed angiogenesis of CAM in vivo at none-cytotoxic doses. Conclusio : Paclitaxel demo trated antiangiogenesis ability without obvious cytotoxicity.

Keywords: Paclitaxel; Angiogenesis/Tumor; HUVEC; Chick chorioallantoic membrane

0 引言

肿瘤生长是血管依赖性的，血管生成涉及肿瘤从形成到转移的全过程(1)。大量证据表明，肿瘤血管在肿瘤从良性向恶性的转变、癌细胞进入血液循环以及转移灶的形成和发展中都起着重要作用。因此，肿瘤的抗血管治疗提供了针对肿瘤发生、发展过程中多个环节的全新治疗思路，具有良好的应用前景。目前已经发现不少药物都有抗血管形成能力并已进入临床应用，如：T -470，干扰素、内皮抑素等，令人感兴趣的是一些已在临床广泛应用的化疗药物也具有血管生成抑制活性，并且在研究中取得了显著的血管抑制效果。紫杉醇是从紫杉树皮中提取出的天然抗肿瘤物质，通过促进微管聚合、抑制微管解聚，使肿瘤细胞阻滞于G2/M期，对多种肿瘤都具有较强的细胞毒作用(2)。近年的研究发现，紫杉醇在不同浓度下可以表现多种不同的作用，如：对肿瘤细胞的直接杀伤作用，诱导细胞凋亡的作用，等等(3)。本实验通过MTT细胞增殖抑制实验和CAM模型，探讨紫杉醇的抗肿瘤血管生成能力。

1、 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肝癌7721细胞株购自上海细胞研究所，本室传代培养。

1.1.2 试剂来源 紫杉醇注射剂（分子量=8523.92），由北京四环医药科技股份有限公司生产；RPMI-1640购自美国GIBCO公司。I型胶原酶及M199培养液购自美国GIBCO公司，Hanks平衡盐溶液由我室自配。

1.1.3 受精种鸡蛋 购自南京市汤泉种鸡厂，于我室孵育箱37℃孵育至第7天使用。

1.2方法

1.2.1 脐静脉内皮细胞的消化和培养(4) 超净台内将20-30cm长的新鲜脐带(我院妇产科提供)表面及脐静脉内壁以Hanks平衡盐溶液冲洗干净，0.1%胶原酶12ml于37℃消化静脉管腔壁20min，消化液冲入锥形离心瓶内1000rpm/min离心10min，弃去上清后加入10mlM199培养液混匀，以每孔0.2ml接种入96孔培养板中，置于CO2孵箱在5% CO2，37℃条件下孵育。12小时后换液一次，以后每2-3天换液，待细胞渐融合时使用。

1.2.2 MTT法测定药物的细胞毒作用(5) 以1640培养液配制不同浓度的紫杉醇溶液，浓度梯度为14nmol/ml、7nmol/ml、3.5nmol/ml和1nmol/ml。以含不同浓度待测药物的培养液为接种7721肿瘤细胞（2×103/孔）并孵育24小时的培养孔换液，每组药物浓度设3个复孔，同时设置6个不加药的对照孔，继续孵育72小时，每孔加入50ulMTT（5mg/ml）孵育4小时后弃培养液，加入150ulDMSO振荡5min，用酶联仪在570nm波长下测光吸收值，并计算细胞生长抑制率。内皮细胞的细胞毒实验以此类推，但培养液改为M199。

细胞存活率=实验组A值/对照组A值 × 100%

1.2.3 甲基纤维素片的制备(6) 甲基纤维素溶解于双蒸水中，浓度0.5%，过夜使甲基纤维素充分溶解，高压灭菌后备用在塑料板上制作直径4mm的圆形凹槽，紫外线照射灭菌。将甲基纤维素溶液加入凹槽内，以恰好铺满底为宜，超净台内吹干。重复上述操作6次，最后一次将槽内形成的甲基纤维素薄膜轻轻揭下，无菌保存备用。

1.2.4 药物对鸡胚尿囊膜血管生成的影响(7) 受精White Leghorn鸡蛋（10/组）在37℃衡湿条件下孵育，于第3天在蛋壳上开窗暴露尿囊膜后用消毒薄膜封闭窗口，继续孵育至第7天。将甲基纤维素薄片放置于尿囊膜毛细血管新生区，用微量加样器将14nmol/ml、7nmol/ml、3.5nmol/ml和1nmol/ml的紫杉醇溶液（无菌生理盐水配制）和无菌生理盐水（对照）各20ul加于纤维素薄片上继续孵育，每天追加相同剂量的药物，72小时后观察甲基纤维素薄片周围毛细血管生长情况。判断标准：1、不影响血管新生（－），即甲基纤维素薄片覆盖区域及周围血管形成正常；2、影响不明显（±），即无血管区只出现在薄片覆盖部

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